當(dāng)今市場(chǎng)上的液相色譜方法有兩種不同的洗脫形式：等度洗脫或梯度洗脫。*初，所有液相色譜方法都是從等度泵開始的，因?yàn)槭袌?chǎng)上**個(gè)檢測(cè)器（折射檢測(cè)器或簡(jiǎn)稱RI）只能與單一溶劑一起使用。但是隨著UV檢測(cè)器的出現(xiàn)，分離方法轉(zhuǎn)向了梯度洗脫分析，以改善液相色譜峰形，并減少樣品的分析時(shí)間。因此，當(dāng)科學(xué)家開發(fā)現(xiàn)代梯度液相色譜方法時(shí)，將使用下面兩種類型的泵中的一種進(jìn)行分析：高壓二元泵梯度洗脫、或者低壓四元比例閥洗脫。
高壓二元泵梯度泵的原理
在二元泵中，色譜一次只能將兩種溶劑合并在一起以形成梯度。這是通過(guò)擁有兩個(gè)獨(dú)立的泵來(lái)完成的，每個(gè)泵為特定的溶劑提供流量。然后將溶劑在位于泵后的混合器中合并。因?yàn)槿軇┰诘竭_(dá)混合發(fā)生的混合點(diǎn)之前就已經(jīng)處于高壓下，所以這會(huì)形成高壓配比形態(tài)。
舉例來(lái)說(shuō)，假設(shè)LC一種方法以65:35的比例運(yùn)行溶劑A和溶劑B。如果LC目標(biāo)流速為1.0 mL / min，則溶劑泵A將為溶劑A輸送0.65 mL / min，溶劑泵B為溶劑B輸送0.35 mL / min的流量。那么合并流量就會(huì)以設(shè)定的比例運(yùn)行。
四元梯度比例閥的原理
低壓四元梯度LC只有一個(gè)泵，用于將流動(dòng)相輸送到色譜柱。梯度是通過(guò)稱為四元梯度比例閥的部件來(lái)實(shí)現(xiàn)的。四元梯度比例閥 結(jié)構(gòu)為四個(gè)隔離溶劑電磁閥組成的閥組模塊，出口合并為一路。四元閥通過(guò)打開四個(gè)溶劑閥的不同時(shí)間和頻率來(lái)實(shí)現(xiàn)梯度，然后將混合溶劑傳遞給泵頭。一旦將混合輸送到泵，柱塞會(huì)將溶劑吸入泵頭，并在湍流環(huán)境中將流動(dòng)相混合在一起。
由于流動(dòng)相在比例閥引入溶劑團(tuán)的位置處沒有壓力，因此通常將四元梯度視為低壓比例梯度。一些系統(tǒng)將增加一個(gè)混合室后泵，以在將梯度混合物輸送到色譜柱之前進(jìn)一步提高流動(dòng)相的均質(zhì)性。
例如，假設(shè)我們希望運(yùn)行一種以25：25：25：25的比例運(yùn)行溶劑A，B，C和D的方法。比例閥將打開每種溶劑的閥，以將相等比例的溶劑團(tuán)輸送到泵頭。
可以以不同的方式創(chuàng)建和傳遞梯度。*初明顯觀察結(jié)論是，四元梯度系統(tǒng)允許使用者同時(shí)使用和混合多達(dá)四種不同的溶劑，從而提供了靈活性。另一方面，二元系統(tǒng)只能同時(shí)限制在兩種不同的溶劑中。
梯度洗脫的方式的討論：二元高壓梯度洗脫和低壓四元梯度洗脫
高效液相色譜儀器的泵或比例閥提供梯度，系統(tǒng)需要混合溶劑以確保將均勻的溶劑輸送至液相色譜柱。當(dāng)前的泵分為兩類：高壓混合（傳統(tǒng)的二元泵）和低壓混合（低壓四元梯度）。
這兩種混合模式之間有什么區(qū)別？
混合模式的影響
這兩種混合模式對(duì)色譜的*大影響是對(duì)駐留體積的影響。駐留體積是從流動(dòng)相開始混合至到達(dá)液相色譜柱為止的體積。該體積越大，新的流動(dòng)相到達(dá)色譜柱所需的時(shí)間越長(zhǎng)。
高壓混合
在高壓二元泵梯度系統(tǒng)的情況下，混合位置出現(xiàn)在混合室中，該混合室位于泵的千方。它的特點(diǎn)是系統(tǒng)的駐留體積較小，因?yàn)樗鶞y(cè)量的體積是從混合器到色譜柱的頭部。這種較低的駐留體積特性導(dǎo)致二元液相色譜系統(tǒng)將梯度變化更快地傳遞到色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)樣品之間更快的再平衡。
低壓混合
對(duì)于低壓四元梯度系統(tǒng)，流動(dòng)相開始混合的位置恰好在比例閥之后。因此，在考慮低壓四元梯度系統(tǒng)中的駐留量時(shí)，必須考慮所有這些量：
· 從閥到泵頭的體積
· 泵頭的體積
· 從泵頭到色譜柱的體積
低壓四元梯度的優(yōu)勢(shì)
1. 低壓四元梯度僅僅使用1個(gè)高壓泵，節(jié)省了采購(gòu)成本和維護(hù)成本。
2. 低壓四元梯度可以使用4種溶劑，更為靈活。包括溶劑洗脫以及沖洗過(guò)程。
低壓四元梯度的歷史：
Spectra-Physics在1970年代末期**引入低壓混合系統(tǒng)（三元）（SP8100）。 Perkin-Elmer（1983年的4系列）引入了使用雙活塞串聯(lián)泵的四元HPLC系統(tǒng)。如今，所有四元梯度洗脫都采用低壓混合設(shè)計(jì)，其中高壓泵從四元梯度比例閥中抽取流動(dòng)相。通過(guò)控制打開每個(gè)溶劑閥來(lái)控制每個(gè)溶劑的通斷頻率和時(shí)間。
雙活塞串聯(lián)泵的**個(gè)活塞在低壓下抽出溶劑，而**個(gè)活塞在高壓下將混合后的溶劑推入色譜柱。通常，溶劑混合會(huì)在**個(gè)活塞缸內(nèi)部進(jìn)行，而在某些設(shè)計(jì)中可以在比例閥之后安裝混合器，例如Agilent 1290四元梯度系統(tǒng)。低壓混合的主要優(yōu)點(diǎn)是固有的簡(jiǎn)單性和較低的成本，因?yàn)閮H需要一個(gè)高壓泵。
